Obtención de la proteína verde fluorescente recombinante y su anticuerpo policlonal Igy

La Proteína Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) es ampliamente utilizada en ensayos in vivo e in vitro. Se han generado múltiples variantes de esta proteína para diversificar sus características, como la GFP-enhancer (EGFP) que emite una señal de fluorescencia 35 veces mayor en comparación con la proteína silvestre, siendo implementada como proteína fusión en estudios de localización y estabilidad estructural, entre otros. La detección de esta proteína y sus variantes puede ser directa o indirecta, mediante el uso de anticuerpos anti-GFP. Aunque el uso de GFP es generalizado y de evidente utilidad en investigación y en docencia, los insumos para su estudio exhiben un alto costo dado que deben ser importados, constituyendo un recurso limitado en Colombia. El presente trabajo reporta la clonación y expresión de la proteína recombinante 6xHisEGFP, cuya purificación se completó a partir de la fracción soluble e insoluble del sistema heterólogo Escherichia coli mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados y electroforesis preparativa, respectivamente. La proteína purificada se implementó como antígeno para la producción de anticuerpos policlonales aviares (IgY) contra la EGFP, los cuales se obtuvieron desde los huevos colectados y el suero de las sangrías de las gallinas inmunizadas. En este sentido, la estrategia metodológica planteada constituye un avance en el desarrollo de un sistema biotecnológico para la producción nacional de herramientas moleculares como los anticuerpos policlonales aviares a bajo costo.

Green Fluorescent Protein (GFP) is widely used in in vivo and in vitro assays. Multiple variants of this protein have been generated to diversify its characteristics, such as the enhancer GFP (EGFP) that emits a 35-fold higher fluorescence signal compared to the wild-type protein, being implemented as a fusion reporter in localization and structural stability studies, among others. Detection of this protein can be direct or indirect, fusing anti-GFP antibodies. Although the use of GFP is generalized and of evident utility in research and teaching, the molecular tools for its study exhibit a high cost since they must be imported, constituting a limited resource in Colombia. This work reports the cloning and expression of the recombinant protein 6xHisEGFP, which purification was completed from the soluble and insoluble fraction of the heterologous Escherichia coli system by immobilized metal affinity chromatography and preparative SDS-PAGE, respectively. The purified protein was implemented as an antigen to produce avian polyclonal antibodies (IgY) against EGFP, which were obtained from collected eggs and blood serum from immunized hens. In this sense, the proposed methodological strategy constitutes an advance in the development of a biotechnological system for the national production of molecular tools such as avian polyclonal antibodies at low-cost.

Evaluación y caracterización de la sirtuina 2.3 de Giardia duodenalis (CdSir2.3)

La giardiasis es la enfermedad gastrointestinal de mayor incidencia mundial, causada por el protozoario Giardia duodenalis, para la cual no se cuenta con una vacuna o tratamiento eficiente. En aras de buscar nuevos blancos farmacológicos contra este parásito, se han estudiado las enzimas del metabolismo energético, como las sirtuinas, deacetilasas dependientes del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD). Previamente se identificó a GdSir2.1 y GdSir2.2 como deacetilasas dependientes de NAD, con localizaciones subcelulares diferentes. En este trabajo se estudió otro candidato a sirtuina (GdSir2.3) mediante herramientas bioinformáticas para la identificación de características típicas de la familia sirtuina en la secuencia del candidato, y experimentales como la obtención de la proteína recombinante 6xHis-GdSir2.3 que demostró actividad deacetilasa dependiente de NAD y que sirvió como antígeno en la producción de los IgY - α -6xHis-GdSir2.3 para la localización subcelular de la proteína endógena en G. duodenalis. Lo anterior concuerda con otros estudios donde se señala a GdSir2.3 como un importante regulador de la enquistación, debido a su aumento de expresión durante esta etapa del ciclo de vida, constituyéndola como un blanco farmacológico promisorio para el control de esta parasitemia.

Giardiasis is the gastrointestinal disease with the highest incidence worldwide, caused by the protozoan Giardia duodenalis, for which there is no vaccine or efficient treatment. In order to find new pharmacological targets against this parasite, energy metabolism enzymes such as sirtuins, deacetylases dependent on the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), have been studied. GdSir2.1 and GdSir2.2 were previously identified as NAD-dependent deacetylases, with different subcellular locations. In this work, another candidate for sirtuin (GdSir2.3) was studied using bioinformatic tools for the identification of typical characteristics of the sirtuin family in the sequence of the candidate; and experimental ones such as obtaining the recombinant protein 6xHis-GdSir2.3 that demonstrated NAD-dependent deacetylase activity; and that it served as an antigen in the production of IgY - α - 6xHis-GdSir2.3 for the subcellular localization of the endogenous protein in G. duodenalis. The foregoing is consistent with other studies where GdSir2.3 is indicated as an important regulator of encyst due to its increased expression during this stage of the life cycle, constituting it as a promising drug target for the control of this parasitaemia.

A giardíase é a doença gastrointestinal de maior incidência no mundo, causada pelo protozoário Giardia duodenalis, para a qual não existe vacina ou tratamento eficaz. Com o objetivo de encontrar novos alvos farmacológicos contra esse parasita, têm sido estudadas enzimas do metabolismo energético, como as sirtuínas, desacetilases dependentes do dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD). GdSir2.1 e GdSir2.2 foram previamente identificados como desacetilases dependentes de NAD, com diferentes localizações subcelulares. Neste trabalho, outro candidato a sirtuin (GdSir2.3) foi estudado usando ferramentas de bioinformática para a identificação de características típicas da família sirtuin na sequência do candidato; e experimentais, como a obtenção da proteína recombinante 6xHis-GdSir2.3 que demonstrou atividade desacetilase dependente de NAD; e que serviu como antígeno na produção de IgY - α - 6xHis-GdSir2.3 para a localização subcelular da proteína endógena em G. duodenalis. O exposto é consistente com outros estudos em que o GdSir2.3 é apontado como um importante regulador de encisto devido à sua expressão aumentada durante esta fase do ciclo de vida, constituindo-se como um alvo promissor para o controle dessa parasitemia.

Identificación de una triparedoxina peroxidasa citoplasmática en Leishmania braziliensis / Identification of a cytoplasmic tryparedoxin peroxidase from Leishmania braziliensis / Identificação de uma triparedoxina peroxidase citoplasmica de Leishmania braziliensis

Resumen Los sistemas de defensa anti-oxidante utilizados por el parásito intracelular Leishmania braziliensis durante el proceso de infección permiten eliminar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a expensas de equivalentes reductores derivados de la tripanotiona, evitando daños celulares del patógeno. Con el objetivo de identificar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de fármacos contra este parásito, se realizó la detección de la enzima triparedoxina peroxidasa citoplasmática de L. braziliensis (LbTXNPxII), la cual es esencial para disminuir concentraciones tóxicas de peróxido de hidrógeno en el contexto de infección. Para esto se generaron anticuerpos policlonales en modelo aviar, partiendo de la clonación, expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) en el sistema heterólogo Escherichia coli. La proteína purificada se utilizó como antígeno para la producción de anticuerpos IgY, cuya implementación en estudios in situ permitió detectar y localizar la enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) en el citoplasma de promastigotes fijados y verificar su interacción molecular con la nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa, enzima involucrada en la síntesis del NAD. De este modo, se reporta el desarrollo de una herramienta bioquímica para la identificación y estudio de la enzima LbTXNPxII y su participación en vías del metabolismo energético y de defensa anti-oxidante.

Abstract The antioxidant defense systems used by the intracellular parasite Leishmania braziliensis during the infection process make it possible to eliminate reactive oxygen and nitrogen species at the expense of reducing equivalents derived from trypanothione, avoiding cellular damage of the pathogen. In order to identify potential molecular targets for the development of drugs against this parasite, the cytoplasmic tryparedoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII), which is essential to reduce toxic concentrations of hydrogen peroxide in the context of infection, was carried out. In this regard, polyclonal antibodies were generated in an avian model, starting from the cloning, expression, and purification of the recombinant protein 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) in the heterologous system of Escherichia coli. The purified protein was used as an antigen for the production of IgY antibodies, whose implementation in in situ experiments allowed the detection and localization of the endogenous LbTXNPxII enzyme (22kDa) in the cytoplasm of fixed promastigotes, as well as the verification of its molecular interaction with nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of NAD. Thus, the development of a biochemical tool for the identification and study of the LbTXNPxII enzyme and its participation in energy metabolism and antioxidant defense pathways is reported.

Resumo Os sistemas de defesa antioxidante utilizados pelo parasita intracelular Leishmania braziliensis durante o processo de infecção, permitem a eliminação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio em detrimento de equivalentes redutores derivados de tripanotiona, evitando o dano celular do patógeno. Com o objetivo de identificar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de drogas contra esse parasita, foi detectada a enzima citoplasmática triparedoxina peroxidase de L. braziliensis (LbTXNPxII), essencial para reduzir as concentrações tóxicas de peróxido de hidrogênio no contexto de infecção. Para isso, anticorpos policlonais foram gerados em modelo aviário, a partir da clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) no sistema heterólogo de Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada como antígeno para a produção de anticorpos IgY, cuja implementação em experimentos in situ permitiu a detecção e localização da enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) no citoplasma de promastigotas fixos e verificar sua interação molecular com nicotinamida/nicotinato mononucleotídeo adenililtransferase, enzima envolvida na síntese de NAD. Assim, é relatado o desenvolvimento de uma ferramenta bioquímica para a identificação e estudo da enzima LbTXNPxII e sua participação no metabolismo energético e nas vias de defesa antioxidante.

Regulación de la actividad enzimática de la NMNAT de Leishmania braziliensis por péptidos representativos de su extremo N-terminal / Regulation of the enzymatic activity of the NMNAT of Leishmania braziliensis by representative peptides derived from its N-terminus end / Regulação da atividade enzimática do NMNAT de Leishmania braziliensis por peptídeos representativos derivados de sua extremidade N-terminal

Resumen El parásito intracelular Leishmania braziliensis es el agente causal de la leishmaniasis cutánea, enfermedad endémica de zonas tropicales, cuyos tratamientos farmacológicos son tóxicos y para la cual no se dispone de una vacuna en la actualidad. Por esta razón, el estudio de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético del parásito es relevante dada su importancia para la supervivencia del mismo. En este estudio, utilizando como secuencia plantilla los primeros 18 residuos del extremo N-terminal de la proteína nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de L. braziliensis (Lb-NMNAT), se sintetizaron péptidos implementando la estrategia Fmoc/ tert-Butilo en una resina Rink amida MBHA. Los péptidos se purificaron por cromatografía en columna C18 y se caracterizaron mediante RP-HPLC. La proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT se expresó en células Escherichia coli M15 y se purificó parcialmente empleando cromatografía de afinidad a metales inmovilizados. De esta proteína se confirmó su actividad enzimática a través de ensayos enzimáticos directos analizados por RP-HPLC. Los péptidos sintetizados se utilizaron para evaluar su efecto sobre la actividad enzimática de la proteína 6xHisLb-NMNAT, observándose una modulación diferencial, lo cual resulta promisorio para el diseño de herramientas quimioterapéuticas basadas en la secuencia N-terminal de la proteína Lb-NMNAT.

Abstract The intracellular parasite Leishmania braziliensis is the etiological agent of cutaneous leishmaniasis, an endemic disease in the tropics, whose pharmacological treatments are toxic and for which there is currently no vaccine. For this reason, the study of proteins related to the energy metabolism of the parasite is relevant given its importance for its survival. In this study, based on the first 18 residues of the N-terminal end of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyl transferase protein from L. braziliensis (Lb-NMNAT) as a template, peptides were synthesized implementing the Fmoc/tert-Butyl strategy in a Rink amide MBHA resin. The peptides were purified by C18 column chromatography and characterized by RP-HPLC. The recombinant 6xHisLb-NMNAT protein was expressed in Escherichia coli M15 cells and partially purified using immobilized metal affinity chromatography. The enzymatic activity of the protein was confirmed through direct enzymatic assays analyzed by RP-HPLC. The synthesized peptides were used to evaluate their effect on the enzymatic activity of the 6xHisLb-NMNAT protein, observing a differential modulation, which is promising for the design of chemotherapeutic tools based on the N-terminal sequence of the Lb-NMNAT protein.

Resumo O parasita intracelular Leishmania braziliensis é o agente causador da leishmaniose tegumentar, doença endêmica nos trópicos, cujos tratamentos farmacológicos são tóxicos e para a qual não existe vacina atualmente. Por este motivo, o estudo de proteínas relacionadas ao metabolismo energético do parasita é relevante dada a sua importância para a sua sobrevivência. Neste estudo, usando os primeiros 18 resíduos da extremidade N-terminal da proteína adenilil transferase de nicotinamida/mononucleotídeo nicotinato de L. braziliensis (Lb-NMNAT) como uma sequência modelo, os peptídeos foram sintetizados implementando a estratégia Fmoc/tert-Butil em uma resina Rink amida MBHA. Os peptídeos foram purificados por cromatografia em coluna C18 e caracterizados por RP-HPLC. A proteína recombinante 6xHisLb-NMNAT foi expressa em células de Escherichia coli M15 e parcialmente purificada usando cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Desta proteína, sua atividade enzimática foi confirmada por meio de ensaios enzimáticos diretos analisados por RP-HPLC. Os peptídeos sintetizados foram utilizados para avaliar seu efeito na atividade enzimática da proteína 6xHisLb-NMNAT, observando uma modulação diferencial, o que é promissor para o projeto de ferramentas quimioterápicas baseadas na sequência N-terminal da proteína Lb-NMNAT

Functional identification and subcellular localization of NAD kinase in the protozoan parasite Giardia intestinalis / Identificación funcional y localización subcelular de la NAD quinasa en el parásito protozoario Giardia intestinalis / Identificação funcional e localização subcelular da NAD quinase no parasita protozoário Giardia intestinalis

Abstract Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is an essential biomolecule that participates in the redox homeostasis and synthesis of signaling compounds. NAD kinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) is the only enzyme capable of synthesizing NADP. This study offers an approach to the NADP metabolism in the parasite Giardia intestinalis, the etiological agent of giardiasis, a disease of high prevalence in America, Asia and Africa. Through bioinformatics tools a NADK enzyme candidate was identified, whose tertiary structure modeling demonstrated distinctive and universal motifs of characterized NADKs. The corresponding recombinant protein (His-GINADK) was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and its partial purification was achieved by nickel affinity chromatography. Functional identification, which showed NADP synthesis, was completed through enzymatic assays evaluated by RP-HPLC. A cytosolic localization of the endogenous GINADK enzyme was observed in trophozoites throughout indirect immunofluorescence analysis, using polyclonal antibodies produced in mice by its immunization with the His-GINADK protein, purified from inclusion bodies. Taken together, our results contribute to the understanding of the NADP metabolism and the physiological role of NADK in the Giardia model.

Resumen El dinucleótido de adenina y nicotinamida fosfato (NADP) es una biomolécula esencial que participa en la homeostasis redox y en la síntesis de compuestos de señalización. La única enzima capaz de sintetizar NADP es la NAD Quinasa (NADK, EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86). En este estudio se presenta un acercamiento al metabolismo del NADP en el parásito Giardia intestinalis, agente etiológico de la giardiasis, una enfermedad de alta prevalencia en América, África y Asia. Mediante herramientas bioinformáticas se identificó un candidato a NADK, cuya predicción a nivel de estructura terciaria mostró motivos característicos y universales de NADKs previamente caracterizadas. La proteína recombinante correspondiente (His-GINADK) se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó parcialmente mediante cromatografía de afinidad a níquel. La síntesis de NADP por parte de la proteína His-GINADK se comprobó mediante ensayos enzimáticos evaluados por RP-HPLC. Adicionalmente, se determinó una localización subcelular citosólica en trofozoítos del parásito, empleando inmunofluorescencia indirecta y anticuerpos policlonales producidos en modelos murinos inmunizados con la proteína His-GINADK purificada a partir de cuerpos de inclusión. Los resultados obtenidos representan un avance en el entendimiento del metabolismo del NADP y de la importancia fisiológica de la NADK en el modelo de Giardia.

Resumo A nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) é uma biomolécula essencial que participa na homeostase redox e na síntese de importantes compostos de sinalização. A NAD quinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) é a única enzima capaz de sintetizar o NADP. Este estudo apresenta uma abordagem do metabolismo do NADP no parasita Giardia intestinalis que causa giardíase, uma doença de alta prevalência na América, Ásia e África. Através de ferramentas de bioinformática, um candidato a enzima NADK foi identificado no parasita, cuja modelagem de estrutura terciária, demonstra motivos distintos e universais de NADKs caracterizadas. A correspondente proteína recombinante (His-GINADK) foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e a sua purificação parcial foi conseguida por cromatografia de afinidade com níquel. A identificação funcional, que mostrou a síntese de NADP, foi completada através de ensaios enzimáticos avaliados por RP-HPLC. Uma localização citosólica da enzima GINADK endógena foi observada em trofozoítos ao longo da análise de imunofluorescência indireta, utilizando anticorpos policlonais produzidos em camundongos, imunizados com a proteína His-GINADK purificada de corpos de inclusão. Em conjunto, nossos resultados contribuem para a compreensão do metabolismo do NADP e da importância fisiológica do NADK no modelo de Giardia.

Protein-protein interactions of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase of Leishmania braziliensis

BACKGROUND Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) plays a central role in energy metabolism and integrates cellular metabolism with signalling and gene expression. NAD biosynthesis depends on the enzyme nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT; EC: 2.7.7.1/18), in which converge the de novo and salvage pathways. OBJECTIVE The purpose of this study was to analyse the protein-protein interactions (PPI) of NMNAT of Leishmania braziliensis (LbNMNAT) in promastigotes. METHODS Transgenic lines of L. braziliensis promastigotes were established by transfection with the pSP72αneoαLbNMNAT-GFP vector. Soluble protein extracts were prepared, co-immunoprecipitation assays were performed, and the co-immunoprecipitates were analysed by mass spectrometry. Furthermore, bioinformatics tools such as network analysis were applied to generate a PPI network. FINDINGS Proteins involved in protein folding, redox homeostasis, and translation were found to interact with the LbNMNAT protein. The PPI network indicated enzymes of the nicotinate and nicotinamide metabolic routes, as well as RNA-binding proteins, the latter being the point of convergence between our experimental and computational results. MAIN CONCLUSION We constructed a model of PPI of LbNMNAT and showed its association with proteins involved in various functions such as protein folding, redox homeostasis, translation, and NAD synthesis.

Structural insights into Plasmodium falciparum nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase: oligomeric assembly

The biochemical pathways involved in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis converge at the enzymatic step catalysed by nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC: 2.7.7.1). The majority of NMNATs are assembled into homo-oligomeric states that comprise 2-6 subunits. Recently, the NMNAT of Plasmodium falciparum (PfNMNAT) has been identified as a pharmacological target. The enzymatic characterisation, cellular location, and tertiary structure of the PfNMNAT protein have been reported. Nonetheless, its quaternary structure remains to be explored. The present study describes the oligomeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT recombinant protein using immobilised metal affinity chromatography coupled with size exclusion chromatography (SEC) and native protein electrophoresis combined with Ferguson plot graphing. These chromatographic approaches resulted in the elution of an active monomer from the SEC column, whereas the Ferguson plot indicated a dimeric assembly of the 6 x His-PfNMNAT protein.

Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of Trypanosoma cruzi (TcNMNAT): a cytosol protein target for serine kinases

Nicotinamide/nicotinate adenine dinucleotide (NAD+/NaAD) performs essential functions in cell metabolism and energy production due to its redox properties. The nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) enzyme catalyses the key step in the biosynthesis of NAD+. Previously, the enzyme NMNAT was identified in Trypanosoma cruzi (TcNMNAT), a pathogenic agent with epidemiological importance in Latin America. To continue with the functional characterisation of this enzyme, its subcellular location and its possible post-translational modifications were examined in this study. For this, polyclonal antibodies were generated in mice, with soluble and denatured recombinant protein being used to detect the parasite’s NMNAT. Immunodetection assays were performed on whole extracts of T. cruzi, and an approximation of its intracellular location was determined using confocal microscopy on wild and transgenic parasites, which revealed the cytosol distribution patterns. This localisation occurs according to the needs of the dinucleotides that exist in this compartment. Additionally, a bioinformatics study was performed as a first approach to establish the post-translational modifications of the enzyme. Possible phosphorylation events were experimentally analysed by western blot, highlighting TcNMNAT as a potential target for serine kinases.